细胞培养的完整指南：详细步骤与实用技巧

细胞培养是一种在体外条件下进行的生物技术，通过提供适合的营养和环境，使得细胞在实验室环境中得以生长、分裂和增殖。它在生命科学研究、药物开发、疫苗生产和基因工程等领域有着广泛的应用。下面是细胞培养的详细步骤指南，包括培养条件、培养基准备、无菌操作、细胞接种与传代等内容。

细胞培养的基础知识

细胞种类

原代细胞：直接从组织或器官中分离获得的细胞，通常代表体内的正常细胞状态。

传代细胞系：原代细胞培养传代后形成的细胞系，可以有限或无限次传代。

永生化细胞系：经过特定处理（如病毒转化、化学诱变等）后可以无限次传代的细胞系，如HeLa细胞、HEK293细胞等。

细胞培养的目标

维持细胞存活：提供适宜的营养、温度、pH等条件。

促进细胞增殖：提供分裂增殖的微环境。

保持细胞特性：确保培养条件下细胞保持其正常的表型和功能。

细胞培养的基本步骤

设备与材料准备

无菌操作设备：生物安全柜（或超净工作台）、无菌移液管、移液器、吸头等。

细胞培养设备：CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、水浴锅等。

培养耗材：细胞培养瓶、培养皿、离心管等。

无菌液体：PBS缓冲液、培养基、胰蛋白酶等。

培养基的准备

成分： 通常由基础培养基、血清和添加剂组成。

基础培养基： 如DMEM、RPMI-1640、MEM等，根据细胞类型选择适当的基础培养基。

血清： 通常使用胎牛血清（FBS），以10%（v/v）比例加入培养基中。

添加剂： 如抗生素（青霉素/链霉素），谷氨酰胺、Hepes缓冲液、胰岛素、维生素等，根据需要添加。

培养基配制步骤

1. 称取基础培养基粉末或使用即用型液体培养基。

2. 加入无菌蒸馏水或无菌PBS缓冲液。

3. 加入血清和其他添加剂。

4. 调节pH值至7.2-7.4。

5. 无菌过滤： 使用0.22µm滤膜过滤培养基以除去杂质和污染物。

6. 储存： 4℃冷藏储存，避免长时间储存。

无菌操作

细胞培养过程中，保持无菌操作非常重要，以避免细菌、真菌和支原体的污染。

1. 洗手和穿戴： 使用酒精消毒洗手，穿无菌手套，戴口罩和实验服。

2. 清洁操作区域： 生物安全柜内用70%乙醇擦拭并保持风机运行10-15分钟。

3. 无菌移液： 使用无菌移液管或移液器移液，避免交叉污染。

4. 处理污染物： 将使用过的移液管、培养基等置于含有消毒液的容器中。

细胞接种

1. 复苏细胞：

准备：准备预热的培养基和胰蛋白酶溶液。

解冻：将细胞冻存管从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中融化。

移液：使用无菌移液管将细胞悬液转移到含10ml预热培养基的   

离心： 以1000 rpm离心5分钟，去除上清液。

重悬：用适量的预热培养基重悬细胞沉淀，混匀后转移至细胞培养瓶中。

培养：将细胞培养瓶放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

2. 直接接种：

准备：预热培养基和胰蛋白酶溶液。

取出细胞悬液：将待接种的细胞悬液从原培养瓶中取出。

接种：按比例将细胞悬液均匀分配到新的培养瓶中，加入适量预热培养基。

培养：放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

细胞传代

细胞增殖至培养瓶（或培养皿）底部的70%-90%汇合度时，需要进行传代。传代是指将细胞从当前的培养瓶转移到新的培养瓶中，使其继续增殖。

1. 观察汇合度： 在倒置显微镜下观察细胞汇合度，通常70%-90%时可以进行传代。

2. 吸弃旧培养基： 小心吸弃旧培养基，避免损伤细胞。

3. 胰蛋白酶消化：

   - 冲洗：用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞。

   - 加入胰蛋白酶：加入适量预热的胰蛋白酶溶液，确保覆盖细胞。

   - 孵育：放入37℃培养箱中消化2-5分钟，期间观察细胞的脱附情况。

   - 终止消化：当大部分细胞开始脱附时，立即加入含血清的培养基终止消化。

4. 离心收集细胞： 将细胞悬液转移到离心管中，1000 rpm离心5分钟。

5. 重悬和接种： 去除上清液，用适量预热培养基重悬细胞沉淀，并按比例接种到新的培养瓶中。

6. 培养： 将新的培养瓶放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

细胞计数

为了准确进行细胞接种和实验分析，需对细胞进行计数。

1. 取样： 吸取少量细胞悬液放入离心管中。

2. 稀释： 按1:1比例用台盼蓝染料稀释细胞悬液。

3. 装入计数板： 用移液器将稀释后的细胞悬液装入血球计数板的计数室。

4. 计数： 在显微镜下观察细胞，计数染色的死细胞和未染色的活细胞。

细胞冻存与复苏

细胞冻存可长时间保存细胞，供日后实验使用。

细胞冻存步骤

1. 收集细胞： 按照传代步骤消化、离心收集细胞。

2. 重悬： 用含10%二甲基亚砜（DMSO）和20%血清的培养基重悬细胞沉淀，调整浓度至1-5 × 10⁶ 细胞/ml。

3. 分装冻存管： 将细胞悬液分装到无菌冻存管中，每管1ml。

4. 预冻： 将冻存管放入程序降温盒中，-80℃预冻过夜。

5. 转移液氮： 次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。

细胞复苏步骤

1. 解冻： 将冻存管从液氮中取出，立即置于37℃水浴锅中快速融化。

2. 离心： 将细胞悬液转移到含10ml培养基的离心管中，1000 rpm离心5分钟。

3. 重悬： 用预热培养基重悬细胞沉淀并接种到培养瓶中。

4. 培养： 放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

细胞培养的注意事项

1. 无菌操作： 始终保持无菌操作，确保生物安全柜内的清洁和无菌。

2. 定期检查污染： 定期检测支原体和其他微生物污染，发现污染及时处理。

3. 细胞状态观察： 经常使用显微镜观察细胞的形态和生长状态，避免异常情况。

4. 记录与标记： 每次培养、传代和冻存操作都要详细记录，培养瓶上标明细胞名称、传代次数、日期等信息。

5. 培养基更换： 定期更换培养基，确保细胞获得充足营养。

细胞培养是现代生物学研究的基础技术之一，通过合理的步骤和无菌操作，实验人员可以获得健康、高质量的细胞用于各类科学研究。希望本文提供的细胞培养详细步骤指南能够帮助您在实验室中顺利进行细胞培养，并获得优质的实验结果。